白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp（WSSV）和168 bp（血卵涡鞕虫）,与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

梭子蟹肌孢虫的组织分布与形式特点

利用透射电镜技术研究了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和形式特点,结果显示,梭子蟹肌孢虫主要寄生在骨骼肌、血淋巴、鳃、胃和肠,而在心脏、肝胰腺、性腺和神经等部位未发现。在胃和肠的结缔组织以及骨骼肌中发现梭子蟹肌孢虫的分裂体,表明其可以在这些组织的细胞中增殖,尤其是在骨骼肌细胞中,大量不同发育时期的虫体显示了该虫对骨骼肌的亲嗜性。梭子蟹肌孢虫的分裂体以及其他增殖期的细胞仅寄生于宿主细胞内,而成熟的孢子可存在于宿主细胞内和细胞外基质中。梭子蟹肌孢虫的孢子有6种存在形式,在宿主细胞内和宿主细胞外基质中各有3种。孢子在宿主细胞内的存在形式:1孢子直接寄生于宿主细胞质中,自由游离,无膜包围;2孢子被单层膜包围,类微绒毛样突起物部分溶解,这种情况见于专业性吞噬细胞——无颗粒细胞内;3孢子被层状环形膜结构包围,类微绒毛样突起物清晰,这种情况见于非专业性吞噬细胞内。孢子在宿主细胞外基质中的存在形式:1孢子自由游离,无膜包围,类微绒毛样突起物清晰;2多个孢子被体液性被囊包围,类微绒毛样突起物清晰;3孢子无膜包围,孢外壁与类微绒毛样突起物消失。本研究阐明了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和孢子的存在形式,为进一步研究微孢子虫在宿主蟹体内的迁移规律提供了重要的基础数据。     

三疣梭子蟹细胞Cdk7基因克隆及其在卵巢发育中的表达

本实验应用RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)周期蛋白依赖性激酶7(Cdk7)基因c DNA序列全长。基因5′和3′非编码区域(UTR)以及开放阅读框的长度分别是23 bp、178 bp和1056 bp,预测编码一个含有351个氨基酸,分子量为39.91 k D的蛋白质,包含一个丝氨酸/苏氨酸催化保守结构域和T-loop结构。同源性分析表明,三疣梭子蟹CDK7氨基酸序列与其他物种Cdk7相似度较高,说明Cdk7基因具有很好的保守性。实时荧光定量PCR结果显示,三疣梭子蟹Cdk7基因在卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P0.05)。Cdk7基因在卵巢发育不同时期的表达量存在差异,其在I期和Ⅱ期的表达量显著高于其他时期(P0.05)。去除眼柄后该基因在卵巢组织中的表达呈现先升高后降低的趋势,并于第4天达到最大值。本研究的结果表明,Cdk7基因参与了三疣梭子蟹卵巢发育调控,为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物性腺发育调控机理研究提供了重要信息。     

三疣梭子蟹核受体基因HR38的克隆及其在蜕皮中的表达分析

采用RACE技术,克隆出三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)核受体基因HR38的c DNA全长,命名为PTHR38。该基因c DNA序列全长为2950 bp,5′和3′非编码区(UTR)长分别为101 bp和551 bp,开放阅读框(ORF)长2298 bp。推测编码765个氨基酸,预测分子量为84.2 k D,理论等电点为6.3。生物学分析预测,PTHR38基因编码的蛋白属于不稳定蛋白,不具有跨膜结构域。同源性分析表明,PTHR38基因编码的氨基酸序列与大型溞(Daphnia magna)的同源性最高。实时荧光定量分析表明,PTHR38基因在蜕皮周期的各个组织中均有差异表达,在眼柄中表达差异最大。去除单侧眼柄后,PTHR38的表达量在整体上呈现不同程度的上升趋势。     

三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析

基于转录组数据库信息,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)钙调蛋白基因(PTCaM)。该基因cDNA全长1981 bp,包含450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,预测分子量16.8 k D,理论等电点为4.09。对序列进行生物信息学分析发现,PTCaM是一个高度保守的序列,具有EF家族典型的EF-hand钙离子结合域。同源性分析结果表明,PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Ca M氨基酸序列覆盖率高达100%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)和仿刺参(Apostichopus japonicus)覆盖率高达99%。系统进化表明,PTCaM基因氨基酸序列与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹和克氏原螯虾聚为一支。通过分析不同蜕皮时期各个组织中PTCaM的表达情况得知,该基因在蜕皮时期的各个组织中均出现差异性表达,并且差异显著,说明该基因参与蜕皮调控过程。     

基于张网渔获的蟹笼渔具对三疣梭子蟹的相对选择性

蟹笼渔具是东海近海重要的作业方式,安装释放装置是改善蟹笼渔具选择性的重要技术手段。作者通过海上试验,对比释放口宽度分别为25 mm和30 mm的试验蟹笼、对照蟹笼和张网的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)渔获,结合渔获方程和SELECT模型分析蟹笼的接触选择性和对张网的相对选择性。试验结果显示,张网渔具所捕获的群体较对照蟹笼更小;对比对照蟹笼渔获分布,分析试验蟹笼的接触选择性,结果显示,50%选择甲宽(l50)和蟹笼的捕捞能力随着释放口宽度的增大而增大,但选择范围(SR)基本不变。对比张网的渔获分布,获得蟹笼对三疣梭子蟹的相对选择性,结合张网和蟹笼的作业特点,将对照蟹笼的相对选择性视为蟹笼渔具的可捕率,结果显示,较大的个体更容易接触并进入蟹笼,50%概率接触并进入蟹笼的个体甲宽为98.7 mm;释放口宽度30 mm的试验蟹笼的相对选择性的l50(118.4 mm)和SR(10.5 mm)与接触选择性的l50(117.4 mm)和SR(9.5 mm)几无差异;对于释放口宽度25 mm的试验蟹笼,接触和相对选择性l50没有差异,但相对选择范围SR(5.6 mm)明显小于接触选择范围(11.3 mm),因此只考虑蟹笼的接触选择性而忽略其可捕率所得的结果可能会产生偏差。根据试验结果,本文对蟹笼渔具的可捕率的描述方式以及与蟹笼作业能力的区别进行了探讨。     

三疣梭子蟹卵巢发育期间Y器官组织学变化

通过活体解剖和组织切片技术,系统研究了三疣梭子蟹卵巢发育过程中Y器官的外观和组织学结构变化。结果表明,三疣梭子蟹Y器官为淡黄色、扁平球状,其中分布有血窦和血管,腺细胞细胞质染色不明显,细胞核呈卵圆形,嗜碱性较强。卵巢发育过程中,Y器官组织学具有以下特征和变化:Ⅰ期,血窦和血管清晰可见,分布于血窦附近的腺细胞膨大呈泡状,且细胞核直径显著大于内部的细胞核直径(P<0.01);Ⅱ期,血管收缩,腺细胞体积变小,胞核直径减少为(3.64±0.62)μm(P<0.01);Ⅲ期,血窦边界模糊,呈退化状态,细胞核呈强嗜碱性;Ⅳ期,Y器官小叶间的空隙变大,腺细胞边界消失,很难发现核仁;Ⅴ期,Y器官小叶间的空隙进一步变大,细胞核直径进一步缩小、核膜皱缩。以上结果表明,三疣梭子蟹卵巢发育过程中,Y器官呈退化的非分泌状态,因此,Y器官可能没有参与卵巢发育的内分泌调控。     

三疣梭子蟹综合养殖技术

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)属甲壳纲、十足目,梭子蟹科,广泛分布于我国沿海,是经济价值较高的大型海产蟹类.20世纪80年代初,山东沿海进行了三疣梭子蟹土池育肥和蓄养试验,并取得了初步成功[1].目前,我国沿海各省均开展了三疣梭子蟹人工养殖,尤其在山东、江苏和河北等省养殖规模较大.三疣梭子蟹人工养殖方式主要有两种:一种是单养[2],另一种是与对虾、贝类等综合养殖[3].笔者对三疣梭子蟹综合养殖技术进行总结,以期为三疣梭子蟹人工养殖提供技术支持.     

盐度胁迫对三疣梭子蟹血清非特异性免疫因子的影响

采用紫外分光光度法和酶学分析方法研究了盐度(14和36)胁迫下12 h内经溶藻弧菌筛选过的三疣梭子蟹F2代(简称筛选蟹F2)的血蓝蛋白含量及血清酶活力的变化,用普通三疣梭子蟹F1代(简称普通蟹F1)作对照。试验结果表明,在高盐和低盐短时胁迫下,筛选蟹F2和普通蟹F1的血蓝蛋白含量、3种保护酶(SOD、POD和CAT)和磷酸酶(ACP和AKP)活力随时间变化呈现有升有降的变化趋势。此外,无论在低盐还是高盐胁迫下,筛选蟹F2的血蓝蛋白含量和各项血清酶活力分别在0 h(正常水平)和盐度胁迫下均显著高于普通蟹F1(P<0.05)。低盐和高盐短时胁迫对三疣梭子蟹的非特异性免疫影响显著且表现出较强的应激反应;在正常和抗盐度胁迫下,筛选蟹F2的非特异性免疫比普通蟹F1更具优势。     

三疣梭子蟹卵黄磷蛋白纯化及其ELISA测定方法

采用凝胶过滤层析法纯化了三疣梭子蟹成熟卵巢的卵黄磷蛋白(vitellin,Vn),采用变性凝胶电泳(SDS-PAGE)确定了Vn亚基数量和分子量,以纯化的Vn为抗原,制备了三疣梭子蟹Vn多克隆抗血清,纯化后得到Vn抗体,在此基础上比较和优化了三疣梭子蟹Vn测定的酶联免疫吸附法(ELISA)参数,建立了稳定的三疣梭子蟹Vn含量测定的ELISA方法。结果表明:(1) SDS-PAGE 显示三疣梭子蟹成熟卵巢中的Vn含有分子量为100、75和66 ku的3个亚基,Western-blotting检测表明,这3个亚基均具有较强的免疫特异性;(2) 样品直接包被法比双抗体夹心法具有更高的线性相关性,Vn抗体最佳稀释倍数为1∶90 000,最佳包被时间为8 h,一抗和二抗反应时间分别为2 h和1 h,显色时间为20 min;(3) 该方法定性检测的灵敏度为14.9 ng/mL左右,标准曲线方程为y=0.000 9x+0.399 1(R²=0.986 1),其中x和y分别代表Vn浓度和OD₄₅₀值,工作范围为200～900 ng/mL;(4) 应用该方法测定三疣梭子蟹卵巢中Vn含量,结果表明,批次内和批次间平均变异系数分别为3.59%和3.10%,重复性良好。